DCS-120 共焦 FLIM 系统

完整的激光共焦扫描FLIM系统，包括显微镜和激光器
现有传统显微镜的共焦 FLIM 升级
由两个BDS-SMps 二极管激光器激发
激发波长从 375 纳米到 640 纳米不等
通过快速振镜扫描
两个共焦检测通道
抑制散射和杂光
通过二向色或偏振分光镜进行通道分离
可单独选择的针孔和滤光片
通过bh 的多维 TCSPC 流程进行记录
两个完全并行的 TCSPC FLIM 通道
时间通道宽度低至 405 fs
超快、超灵敏探测器
前所未有的时间分辨率
检测寿命小于 25 ps
接近理想的光子效率
卓越的寿命可复制性
快速在线 FLIM
百万像素 FLIM，2048 x 2048 像素
精确 FLIM，4096 个时间通道
马赛克 FLIM
Z 叠加 FLIM
快速时间序列累积
激发波长复用
多波长 FLIM
同步 FLIM/PLIM
集成式电动样品台
通过 bhSPCImage NG进行数据分析
通过 GPU 进行超快速处理
时域分析与相位图相结合
通过相位图或二维直方图进行图像分割
衰变数据的 MLE（最大似然估计）拟合
自动 IRF 建模
无需记录 IRF

Description

DCS-120 共焦 FLIM 系统采用ps 二极管激光器激发、振镜快速扫描、共焦检测和bh 的多维 TCSPC 技术进行 FLIM。它以前所未有的时间分辨率、前所未有的重现性、高空间分辨率、高灵敏度和接近理想的光子效率记录荧光寿命图像。荧光寿命可检测到 25 ps；衰变数据可解析为 4096 个时间通道，宽度可达 405 fs。像素格式可增至 2048 x 2048。

DCS 120 系统可用于尼康、蔡司和奥林巴斯的倒置显微镜。它还可用于将现有的传统显微镜转换为带 TCSPC 检测功能的全功能共聚焦或多光子激光扫描显微镜。由于其光束扫描速度快、灵敏度高，DCS-120 系统可用于活细胞成像。

DCS-120 的功能包括在两个完全平行的波长通道中同时记录 FLIM 或稳态荧光图像、激光波长复用、多波长 FLIM、时间序列 FLIM、通过时间马赛克 FLIM 进行超快速时间序列记录、空间马赛克 FLIM、Z 叠加 FLIM、磷光寿命成像（PLIM）、荧光寿命-瞬态扫描（FLITS）和 FCS 记录。应用重点是代谢成像，即利用荧光团与其分子环境相互作用产生的寿命变化。典型应用包括离子浓度测量、FRET 实验、代谢成像、快速生理效应成像和植物生理学。

数据分析由 bh 最新的SPCImage NG FLIM分析软件执行。SPCImage NG 是时域分析和相位分析的结合。通过在 GPU（图形处理器）上运行计算，几秒钟内就能得到结果。其他功能还包括通过相位图或二维时域直方图进行图像分割，以及系统 IRF 自动建模。因此，无需通过记录实际 IRF 进行重复校准。

Specifications

选定规格

原理：利用快速振镜扫描仪扫描，共焦检测，并利用 bh 的多维 TCSPC 技术进行 TCSPC FLIM
激发：皮秒二极管激光器
扫描速率：低至每个像素约一微秒
建立寿命图像：光子在到达时间和扫描坐标上的分布
建立荧光相关数据：绝对光子时间的相关性
一般操作模式双光谱或偏振通道 FLIM、多波长 FLIM、
时间序列 FLIM、Z-堆栈 FLIM、镶嵌 FLIM、x、y、z、时间、激发波长多路复用 FLIM、FLITS（荧光寿命-瞬态扫描）、与 FLIM 同时进行的 PLIM（磷光寿命成像）、FCS、交叉 FCS、门控 FCS、单点荧光衰减记录、单点磷光衰减记录

扫描头
光学原理：共焦，通过快速振镜进行光束扫描
激光输入：两个独立输入，光纤耦合
激光功率调节，光学通过中性密度滤光片轮连续可变
探测器输出：两个输出，探测器直接连接
主分光器版本：多波段二向色、宽波段、多光子
二级分光镜轮三个二向色分光器，偏振分光器，100% 到通道 1，100% 到通道 2
针孔：每个通道独立的针孔轮
针孔对准：电子，通过压电微动平台
针孔尺寸： 11 个针孔，从约 0.5 到 10 AU
发射滤波器：每个通道串联两个滤光片滑块
与显微镜连接：显微镜左侧端口或顶部端口的适配器
ps二极管激光器与扫描头的耦合：单模光纤，每个激光器单独使用
将 Ti:Sa 或 fs 光纤激光器耦合到扫描头、多光子系统：自由光束，直径 1 至 2 毫米

扫描控制器：bh GVD-120
原理数字波形生成，扫描波形由硬件生成
帧尺寸：帧扫描 16 x 16 至 2048 x 2048 像素，行扫描 16 至 2048 像素
X 扫描：连续或逐个像素
Y 扫描：逐行扫描
激光功率控制，电气：软件，激光电信号
激光复用：逐帧、逐行或在一个像素内
光束消隐：飞返期间和扫描停止时
扫描速率：自动选择最快速率或手动选择
扫描区域定义：通过缩放系数和偏移量，或在预览期间通过光标进行交互式操作
快速预览功能：每帧 1 秒，256 x 256 像素
光束驻留功能：通过预览图像中的光标或 FLIM 图像中的光标
激光复用：帧、线或像素复用

TCSPC 系统：bh Simple Tau 或 Power Tau TCSPC 系统
并行 TCSPC / FLIM 通道数：2
TCSPC / FLIM 模块SPC-150NX 或 SPC-180NX
电子时间分辨率1.5 ps RMS / 3.5 ps FWHM
最小时间通道宽度：405 fs
超过 100 秒的定时稳定性： 优于 0.8 ps RMS
30 分钟以上定时稳定性：优于 5 ps RMS
饱和计数率：每个通道 10 MHz
探测器输入恒定分辨器
来自激光器的参考（同步）输入：恒定分辨器
与扫描同步：通过帧时钟、行时钟和像素时钟脉冲
扫描速率：适用于任何扫描速率
与激光复用同步：通过 TCSPC 模块的路由功能
记录多波长数据：通过路由功能同时记录 16 个通道的数据
实验触发功能：TTL，用于 Z 堆栈 FLIM 和显微镜控制的时间序列
TCSPC 系统的操作模式：单 f(t)、示波器、f(txy)、f(t,T)、f(t) 连续流
FIFO（相关/FCS/MCS）模式、扫描同步输入成像、扫描同步输入与连续流
先进先出成像、先进先出成像与 MCS 成像相结合、镶嵌成像、时间序列成像
多探测器操作、激光多路复用操作、循环和重复功能、自动保存功能
显示功能（在线）：强度图像、门控强度图像、寿命图像、ROI 衰减曲线、衰减曲线、FCS 曲线、强度轨迹。
同时显示的图像数量：8
最大图像格式，像素 X x 像素 Y x 时间通道：2048 x 2048 x 256、1024 x 1024 x 1024、512 x 512 x 4096、256 x 256 x 4096

软件
数据采集软件：bh SPCM
扫描仪控制软件：集成在 SPCM 中
操作系统：Windows 10 64 位Windows 10 64 位
数据分析软件：bh SPCImage NG
数据分析原理使用 GPU 处理的 MLE
模型函数单、双、三指数衰减，带不完全衰减的单、双、三指数衰减，移位分量模型。
IRF 建模：衰变数据的合成 IRF 函数拟合

用于共焦 FLIM 的激发光源：两个 BDS-SM ps 二极管激光器
可用波长：375 毫米至 785 纳米
重复率20、50、80 MHz 和 CW
脉冲宽度：40 ps 至 100 ps

探测器HPM-100-40 混合探测器，带 GaAsP 阴极，波长 300 至 720 纳米
可选：HPM-100-06 探测器，FWHM IRF 宽度 <20 ps，波长 300 至 650 nm
可选：HPM-100-50 检测器，波长 400 至 900 纳米
可选：MW-FLIM GaAsPMW-FLIM GaAsP 多波长探测器

完整规格请参阅：

DCS-120 共焦和多光子 FLIM 系统，用户手册

Downloads

Documents

The bh TCSPC Handbook
10th edition, September 2023

View

手册

bh FLIM 系统的应用领域是分子成像。典型的应用包括离子浓度、pH 值或局部粘度成像，通过 FRET 进行蛋白质相互作用实验，以及通过 NADH 和 FAD 的荧光衰减结合氧气测量进行代谢成像。在这些应用中，bh FLIM 系统具有高灵敏度、高时间分辨率、高定时稳定性，并能将多指数衰减曲线分解为各个组成部分。其他优势还包括能够记录毫秒级的快速生理效应 FLIM，以及同时记录多个激发和发射波长。

Applications

Principles

共焦扫描

在传统的荧光显微镜中，荧光是在整个样品深度的双锥面上被激发和检测的，见下图。因此，在焦平面上看到的清晰图像被焦平面上方和下方的离焦雾所包围。对于单细胞的结构成像，这种情况可能还可以接受。但对于 FLIM 而言，即使是少量的焦外模糊也是不可接受的，因为这会给焦平面上的荧光衰减增加不必要的衰减成分。对于厚组织的 FLIM 来说，情况变得完全不可收拾。焦外模糊变得完全无法承受，导致图像对比度几乎完全丧失，衰变成分完全混杂。

解决焦外问题的方法就是共焦检测。其原理如下图左侧所示。显微镜物镜将激光束聚焦到样品中。虽然这束激光在样品的整个深度都能激发荧光，但在激光束的焦点处荧光最亮。来自激光束焦点的光通过显微镜镜头收集回来，通过二向色镜与激光束分离，并聚焦到显微镜镜头上焦平面的针孔中。只有来自焦平面的光才能通过针孔，来自其他平面的光无法聚焦到针孔中，因此无法以明显的效率通过针孔。

扫描
共焦检测原理解决了离焦光线的问题，但其本身并不能提供样品的图像。要获得焦平面内物体的图像，共焦检测必须与扫描相结合。扫描可以通过不同的技术实现，例如移动样品、移动物镜或通过快速移动的反射镜偏转激光束和检测光束。第三种方法是唯一适用于生物样本成像的方法。它速度快，不会对样品施加机械力，可用于任何可置于显微镜下的物体。共焦检测与光束扫描的结合如下图左右所示。激光束被一对快速移动的振镜偏转。扫描镜头将光束向下投射到显微镜镜头。随着镜面的移动，显微镜镜头平面上的光束角度发生变化，样品平面上的激光焦点位置也随之变化。荧光通过相同的光束路径返回。经振镜反射后，形成一束与激光束重合的静止光束，见下图左侧。荧光通过二向色镜与激光分离，并投射到与样品焦平面共轭的针孔中。请看下图右侧。

如上所述，共焦检测与扫描相结合可以解决显微镜中的离焦问题。然而，扫描的作用远不止于此。它还能避免样品中的散射光造成像素之间的横向串扰。令人惊讶的是，显微镜文献中很少提到这一点。考虑一个成像系统，它可以同时照亮整个样品，并通过摄像头从焦平面检测图像。在该图像的所有像素中，相机将检测到来自照明区域内所有其他像素的散射光，见下图左侧。扫描系统--用聚焦激光束扫描样品，只检测激发光点的光--只记录当前像素的光（右图）。即使有部分光在样品中散射，成像系统也会将散射光子分配到正确的像素上。

抑制侧向散射光意味着，在没有共焦检测的帮助下，仅靠扫描就能极大地提高光学厚样品的图像质量。下图是一个例子。从左到右依次是用普通照相机、无针孔扫描和检测以及通过针孔共焦检测记录的猪皮样本图像。照相机图像（左图）没有显示样品内部的任何情况，扫描图像（中图）显示了内部结构，共焦图像（右图）显示了没有焦外混浊的内部结构。

与 TCSPC FLIM 相结合
bh FLIM 系统采用多维 TCSPC 技术。这意味着，通过针孔的单光子会被检测到，激发脉冲周期内的光子时间和光子检测时刻的激光束位置也会被确定，并在这些参数上建立光子分布。其结果是一个像素阵列，每个像素包含大量连续时间通道中的光子数。请参见下图。

TCSPC-FLIM 记录过程可在任何扫描速率下工作，实现近乎理想的光子效率，在每个像素中提供解析度极高的衰变函数，并达到极高的时间分辨率。信噪比只取决于样本的光子率和总的采集时间。通过增加光子分布的额外维度，可以积累多波长 FLIM 图像、多激发波长图像、荧光/磷光组合图像以及样品中快速生理效应的图像。与所有 bh FLIM 系统一样，DCS-120 TCSPC 系统有两个并行 TCSPC 通道，可在不同波长间隔或不同偏振角度下进行检测。
详情请参阅《bh TCSPC 手册》和《DCS-120 共聚焦和多光子 FLIM 系统手册》。