![](https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2018/11/DCS-120-toptica-01-wbk-comp80-1024x639.jpg)
- 完整的多光子FLIM系统,包括显微镜和激光器
- 现有传统显微镜的多光子 FLIM 升级
- 由钛:萨或飞秒光纤激光器激发
- 提供组合式多光子/共焦系统
- 激光控制集成在系统软件中
- 激发波长从 650 纳米到 1200 纳米不等
- 通过快速振镜扫描
- 两个非扫描检测通道
- 通过二向色或偏振分光镜进行通道分离
- 通过bh 的多维 TCSPC 流程进行记录
- 两个完全并行的 TCSPC FLIM 通道
- 时间通道宽度低至 203 fs
- 超快、超灵敏探测器
- 前所未有的时间分辨率
- 检测寿命小于 10 ps
- 接近理想的光子效率
- 卓越的寿命可重复性
- 快速在线 FLIM
- 百万像素 FLIM,2048 x 2048 像素
- 精确 FLIM,4096 个时间通道
- 马赛克 FLIM
- Z 叠加 FLIM
- 快速时间序列累积
- 多波长 FLIM
- 同步 FLIM/PLIM
- 集成式电动样品台
- 通过bh SPCImage NG进行数据分析
- GPU 超快速处理
- 时域分析与相位图相结合
- 通过相位图或二维直方图进行图像分割
- 衰减曲线的 MLE 拟合
- 自动 IRF 建模
- 无需记录 IRF
Description
DCS-120 MP 系统采用飞秒激光脉冲多光子激发、振镜快速扫描、共焦检测以及bh 的多维 TCSPC 技术进行荧光成像。它以前所未有的时间分辨率、前所未有的重现性、高空间分辨率、高灵敏度和接近理想的光子效率记录荧光寿命图像。对荧光寿命的检测可低至 10 ps;衰变数据可分辨为 4096 个时间通道,宽度可低至 203 fs。像素格式可增至 2048 x 2048。
为了利用多光子激发的高穿透深度,DCS-120 MP 采用了非扫描检测。 MP 系统可用于尼康、蔡司和奥林巴斯的倒置显微镜。由于其光束扫描速度快、灵敏度高,DCS-120 系统可用于活细胞成像。DCS-120 的功能包括在两个完全平行的波长通道中同时记录 FLIM 或稳态荧光图像、激光波长复用、时间序列 FLIM、时间序列记录、Z 叠 FLIM、磷光寿命成像(PLIM)、荧光寿命瞬时扫描(FLITS)和 FCS 记录。其应用重点是荧光团与其分子环境的相互作用引起的寿命变化。典型应用包括离子浓度测量、FRET 实验、代谢成像、快速生理效应成像和植物生理学。
DCS-120 MP 多光子荧光成像系统可配备钛蓝宝石激光器和飞秒光纤激光器。两种版本如下图左右所示。钛-蓝宝石激光器系统具有可调谐性和高激光功率的优点。高功率允许使用 AOM(声光调制器)进行软件控制的强度调节、快速光束消隐和像素同步开关调制,以便同时进行 FLIM /PLIM 操作。另一方面,光纤激光系统结构紧凑,易于使用,几乎无需维护。缺点是波长固定为 780 纳米。不过,缺乏可调性并不像人们通常认为的那样是个问题:大多数荧光团的双光子吸收带都很宽,足以在此波长下激发它们。此外,780 纳米也是激发 NADH 的最佳波长。因此,光纤激光系统几乎是理想的多光子代谢-荧光成像系统。
Specifications
选定规格
原理:利用快速振镜扫描仪扫描,共焦检测,并利用 bh 的多维 TCSPC 技术进行 TCSPC FLIM
激发:皮秒二极管激光器
扫描速率:低至每个像素一微秒
建立寿命图像:光子在到达时间和扫描坐标上的分布
建立荧光相关数据:绝对光子时间的相关性
一般操作模式双光谱或偏振通道 FLIM、多波长 FLIM、
时间序列 FLIM、Z-堆栈 FLIM、镶嵌 FLIM、x、y、z、时间、激发波长多路复用 FLIM、FLITS(荧光寿命-瞬态扫描)、与 FLIM 同时进行的 PLIM(磷光寿命成像)、FCS、交叉 FCS、门控 FCS、单点荧光衰减记录、单点磷光衰减记录
光学系统:DCS-120 扫描头
光学原理:共焦,通过快速振镜进行光束扫描
激光输入:两个独立输入,光纤耦合
激光功率调节,光学通过中性密度滤光片轮连续可变
探测器输出:两个输出,探测器直接连接
主分光器版本:多波段二向色、宽波段、多光子
二级分光镜轮三个二向色分光器,偏振分光器,100% 到通道 1,100% 到通道 2
针孔:每个通道独立的针孔轮
针孔对准:电子,通过压电微动平台
针孔尺寸: 11 个针孔,从约 0.5 到 10 AU
发射滤波器:每个通道串联两个滤光片滑块
与显微镜连接:与显微镜左侧端口或顶部端口的适配器
将 Ti:Sa 或 fs 光纤激光器耦合到扫描头:自由光束,直径 1 至 2 毫米
耦合附加 ps 二极管激光器:单模光纤
扫描控制器:bh GVD-120
原理数字波形生成,扫描波形由硬件生成
帧尺寸帧扫描 16 x 16 至 2048 x 2048 像素,行扫描 16 至 2048 像素
X 扫描:连续或逐个像素
Y 扫描:逐行扫描
激光功率控制,电气:软件,激光电信号
激光复用:逐帧、逐行或在一个像素内
光束消隐:飞返期间和扫描停止时
扫描速率:自动选择最快速率或手动选择
扫描区域定义:通过缩放系数和偏移量,或在预览期间通过光标进行交互式操作
快速预览功能:每帧 1 秒,256 x 256 像素
光束驻留功能:通过预览图像中的光标或 FLIM 图像中的光标
激光复用:帧、线或像素复用
TCSPC 系统:bh Simple Tau 或 Power Tau TCSPC 系统
并行 TCSPC / FLIM 通道数:2
TCSPC / FLIM 模块SPC-150NX 或 SPC-180NX
电子时间分辨率1.5 ps RMS / 3.5 ps FWHM
最小时间通道宽度:405 fs
100 秒以上定时稳定性: 优于 0.8 ps RMS
30 分钟以上定时稳定性:优于 5 ps RMS
饱和计数率:每个通道 10 MHz
探测器输入恒定分辨器
来自激光器的参考(同步)输入:恒定分辨器
与扫描同步:通过帧时钟、行时钟和像素时钟脉冲
扫描速率:适用于任何扫描速率
与激光复用同步:通过 TCSPC 模块的路由功能
记录多波长数据:通过路由功能同时记录 16 个通道的数据
实验触发功能:TTL,用于 Z 堆栈 FLIM 和显微镜控制的时间序列
TCSPC 系统的操作模式:单 f(t)、示波器、f(txy)、f(t,T)、f(t) 连续流
FIFO(相关/FCS/MCS)模式、扫描同步输入成像、扫描同步输入与连续流
FIFO 成像、与 MCS 成像相结合的 FIFO 成像、镶嵌成像、时间序列成像
多探测器操作、激光多路复用操作、循环和重复功能、自动保存功能
显示功能(在线):强度图像、门控强度图像、寿命图像、ROI 衰减曲线、衰减曲线、FCS 曲线、强度轨迹。
同时显示的图像数量:8
最大图像格式,像素 X x 像素 Y x 时间通道:2048 x 2048 x 256、1024 x 1024 x 1024、512 x 512 x 4096、256 x 256 x 4096
软件
数据采集软件:bh SPCM
扫描仪控制软件:集成在 SPCM 中
操作系统:Windows 10 64 位Windows 10 64 位
数据分析软件:bh SPCImage NG
数据分析原理使用 GPU 处理的 MLE
模型函数单、双、三指数衰减,带不完全衰减的单、双、三指数衰减,移位分量模型。
IRF 建模:衰变数据的合成 IRF 函数拟合
激发光源
多光子 FLIM:Ti:Sa 激光器或 fs 光纤激光器
共焦 FLIM:系统中可耦合一个额外的 BDS-SM ps 二极管激光器。
检测器:
NDD 检测器:直接耦合到显微镜
共焦检测器:直接耦合到扫描头
标准探测器:HPM-100-40 混合探测器,带砷化镓阴极,波长 300 至 720 纳米
选配:HPM-100-06 探测器,<20 ps FWHM IRF 宽度,300 至 650 纳米
可选:HPM-100-50 检测器,400 至 900 纳米
可选:MW-FLIM GaAsPMW-FLIM GaAsP 多波长探测器
完整规格请参阅:
Downloads
Documents
手册
- DCS-120 Confocal and Multiphoton FLIM Systems – Overview Brochure
- FLIM Systems for Laser Scanning Microscopes – Overview Brochure
- Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM Results
- SPCImage NG – Overview Brochure
- The bh FLIM Technique – More than Lifetime Imaging
- DCS-120 Confocal and Multiphoton FLIM Systems – User Handbook 9th ed. 2021
bh FLIM 系统的应用领域是分子成像。典型的应用包括离子浓度、pH 值或局部粘度成像,通过 FRET 进行蛋白质相互作用实验,以及通过 NADH 和 FAD 的荧光衰减结合氧气测量进行代谢成像。在这些应用中,bh FLIM 系统具有高灵敏度、高时间分辨率、高定时稳定性,并能将多指数衰减曲线分解为各个组成部分。其他优势还包括能够记录毫秒级的快速生理效应 FLIM,以及同时记录多个激发和发射波长。
Principles
多光子激发
多光子激发利用两个或多个激发光的光子来激发一个荧光光子,见下图左侧。要使这一过程达到明显的效率,需要极高的空间和时间功率密度。使用飞秒脉冲并通过高纳秒显微镜物镜聚焦,就能实现这两点,见下图(右)。脉冲持续时间为 100 fs,重复频率为 80 MHz,通过 NA = 1.3 的镜头聚焦,不需要超过 5 mW 就能获得显微镜中使用的大多数荧光染料的明亮荧光。在大多数情况下,"多光子 "激发只需使用两个光子。要获得可见光区域的荧光,激光波长必须在近红外(NIR)区域。钛:萨激光器、OPO 和飞秒光纤激光器可用于产生所需的激发波长。
与单光子激发相比,多光子激发有许多优点。
首先,样品在激发波长处的吸收率较低。此外,散射系数也低于可见光或紫外线波长。因此,双光子(或一般情况下的多光子)激发比单光子激发更深入组织,见下图左右两侧。因此,多光子激发可用于激发生物组织深层的荧光。
其次,激发被限制在功率密度较高的焦点体积内。在扫描系统中,这自动意味着激发被限制在焦平面内。这意味着无需共焦针孔来阻挡焦平面以外的光线。多光子激发本质上提供了焦外抑制功能,因此也提供了光学切片能力。
多光子激发不会激发焦平面外的荧光,这一事实带来了多光子激发的第三个优势,即检测样品内部的散射光。来自深焦平面的可见光在流出样品的过程中会发生大量散射,见下图左侧。这种光无法准直,因此无法聚焦到共聚焦针孔中。但是,没有必要通过扫描仪和针孔将光线送回。取而代之的是,光线可以直接从显微镜镜头后方转向探测器。通过投射显微镜镜头的图像(而不是样品中的图像平面),散射光子的大部分会被传送到检测器。这一原理被称为非扫描探测,见下图右侧。
与 bh TCSPC FLIM 系统结合使用的第四个优势是极高的时间分辨率。激发脉冲具有飞秒脉冲宽度。因此,FLIM 系统的仪器响应函数(IRF)不会因激发脉冲而变宽。利用快速混合探测器,IRF 宽度可低至 20 ps (fwhm)。直接记录超快荧光衰减现象的能力为 FLIM 应用开辟了一个全新的领域。请参阅有关蘑菇孢子和花粉粒中的超快衰减及其在亚 10 ps 范围内的测量的应用说明。