DCS-120 MP 多光子 FLIM 系统

Description

DCS-120 MP 系统采用飞秒激光脉冲多光子激发、振镜快速扫描、共焦检测以及bh 的多维 TCSPC 技术进行荧光成像。它以前所未有的时间分辨率、前所未有的重现性、高空间分辨率、高灵敏度和接近理想的光子效率记录荧光寿命图像。对荧光寿命的检测可低至 10 ps；衰变数据可分辨为 4096 个时间通道，宽度可低至 203 fs。像素格式可增至 2048 x 2048。

为了利用多光子激发的高穿透深度，DCS-120 MP 采用了非扫描检测。 MP 系统可用于尼康、蔡司和奥林巴斯的倒置显微镜。由于其光束扫描速度快、灵敏度高，DCS-120 系统可用于活细胞成像。DCS-120 的功能包括在两个完全平行的波长通道中同时记录 FLIM 或稳态荧光图像、激光波长复用、时间序列 FLIM、时间序列记录、Z 叠 FLIM、磷光寿命成像（PLIM）、荧光寿命瞬时扫描（FLITS）和 FCS 记录。其应用重点是荧光团与其分子环境的相互作用引起的寿命变化。典型应用包括离子浓度测量、FRET 实验、代谢成像、快速生理效应成像和植物生理学。

DCS-120 MP 多光子荧光成像系统可配备钛蓝宝石激光器和飞秒光纤激光器。两种版本如下图左右所示。钛-蓝宝石激光器系统具有可调谐性和高激光功率的优点。高功率允许使用 AOM（声光调制器）进行软件控制的强度调节、快速光束消隐和像素同步开关调制，以便同时进行 FLIM /PLIM 操作。另一方面，光纤激光系统结构紧凑，易于使用，几乎无需维护。缺点是波长固定为 780 纳米。不过，缺乏可调性并不像人们通常认为的那样是个问题：大多数荧光团的双光子吸收带都很宽，足以在此波长下激发它们。此外，780 纳米也是激发 NADH 的最佳波长。因此，光纤激光系统几乎是理想的多光子代谢-荧光成像系统。

Specifications

选定规格

原理：利用快速振镜扫描仪扫描，共焦检测，并利用 bh 的多维 TCSPC 技术进行 TCSPC FLIM
激发：皮秒二极管激光器
扫描速率：低至每个像素一微秒
建立寿命图像：光子在到达时间和扫描坐标上的分布
建立荧光相关数据：绝对光子时间的相关性
一般操作模式双光谱或偏振通道 FLIM、多波长 FLIM、
时间序列 FLIM、Z-堆栈 FLIM、镶嵌 FLIM、x、y、z、时间、激发波长多路复用 FLIM、FLITS（荧光寿命-瞬态扫描）、与 FLIM 同时进行的 PLIM（磷光寿命成像）、FCS、交叉 FCS、门控 FCS、单点荧光衰减记录、单点磷光衰减记录

光学系统：DCS-120 扫描头
光学原理：共焦，通过快速振镜进行光束扫描
激光输入：两个独立输入，光纤耦合
激光功率调节，光学通过中性密度滤光片轮连续可变
探测器输出：两个输出，探测器直接连接
主分光器版本：多波段二向色、宽波段、多光子
二级分光镜轮三个二向色分光器，偏振分光器，100% 到通道 1，100% 到通道 2
针孔：每个通道独立的针孔轮
针孔对准：电子，通过压电微动平台
针孔尺寸： 11 个针孔，从约 0.5 到 10 AU
发射滤波器：每个通道串联两个滤光片滑块
与显微镜连接：与显微镜左侧端口或顶部端口的适配器
将 Ti:Sa 或 fs 光纤激光器耦合到扫描头：自由光束，直径 1 至 2 毫米
耦合附加 ps 二极管激光器：单模光纤

扫描控制器：bh GVD-120
原理数字波形生成，扫描波形由硬件生成
帧尺寸帧扫描 16 x 16 至 2048 x 2048 像素，行扫描 16 至 2048 像素
X 扫描：连续或逐个像素
Y 扫描：逐行扫描
激光功率控制，电气：软件，激光电信号
激光复用：逐帧、逐行或在一个像素内
光束消隐：飞返期间和扫描停止时
扫描速率：自动选择最快速率或手动选择
扫描区域定义：通过缩放系数和偏移量，或在预览期间通过光标进行交互式操作
快速预览功能：每帧 1 秒，256 x 256 像素
光束驻留功能：通过预览图像中的光标或 FLIM 图像中的光标
激光复用：帧、线或像素复用

TCSPC 系统：bh Simple Tau 或 Power Tau TCSPC 系统
并行 TCSPC / FLIM 通道数：2
TCSPC / FLIM 模块SPC-150NX 或 SPC-180NX
电子时间分辨率1.5 ps RMS / 3.5 ps FWHM
最小时间通道宽度：405 fs
100 秒以上定时稳定性： 优于 0.8 ps RMS
30 分钟以上定时稳定性：优于 5 ps RMS
饱和计数率：每个通道 10 MHz
探测器输入恒定分辨器
来自激光器的参考（同步）输入：恒定分辨器
与扫描同步：通过帧时钟、行时钟和像素时钟脉冲
扫描速率：适用于任何扫描速率
与激光复用同步：通过 TCSPC 模块的路由功能
记录多波长数据：通过路由功能同时记录 16 个通道的数据
实验触发功能：TTL，用于 Z 堆栈 FLIM 和显微镜控制的时间序列
TCSPC 系统的操作模式：单 f(t)、示波器、f(txy)、f(t,T)、f(t) 连续流
FIFO（相关/FCS/MCS）模式、扫描同步输入成像、扫描同步输入与连续流
FIFO 成像、与 MCS 成像相结合的 FIFO 成像、镶嵌成像、时间序列成像
多探测器操作、激光多路复用操作、循环和重复功能、自动保存功能
显示功能（在线）：强度图像、门控强度图像、寿命图像、ROI 衰减曲线、衰减曲线、FCS 曲线、强度轨迹。
同时显示的图像数量：8
最大图像格式，像素 X x 像素 Y x 时间通道：2048 x 2048 x 256、1024 x 1024 x 1024、512 x 512 x 4096、256 x 256 x 4096

软件
数据采集软件：bh SPCM
扫描仪控制软件：集成在 SPCM 中
操作系统：Windows 10 64 位Windows 10 64 位
数据分析软件：bh SPCImage NG
数据分析原理使用 GPU 处理的 MLE
模型函数单、双、三指数衰减，带不完全衰减的单、双、三指数衰减，移位分量模型。
IRF 建模：衰变数据的合成 IRF 函数拟合

激发光源
多光子 FLIM：Ti:Sa 激光器或 fs 光纤激光器
共焦 FLIM：系统中可耦合一个额外的 BDS-SM ps 二极管激光器。

检测器：
NDD 检测器：直接耦合到显微镜
共焦检测器：直接耦合到扫描头
标准探测器：HPM-100-40 混合探测器，带砷化镓阴极，波长 300 至 720 纳米
选配：HPM-100-06 探测器，<20 ps FWHM IRF 宽度，300 至 650 纳米
可选：HPM-100-50 检测器，400 至 900 纳米
可选：MW-FLIM GaAsPMW-FLIM GaAsP 多波长探测器

完整规格请参阅：

DCS-120 共焦和多光子 FLIM 系统，用户手册

Downloads

Documents

bh FLIM 系统的应用领域是分子成像。典型的应用包括离子浓度、pH 值或局部粘度成像，通过 FRET 进行蛋白质相互作用实验，以及通过 NADH 和 FAD 的荧光衰减结合氧气测量进行代谢成像。在这些应用中，bh FLIM 系统具有高灵敏度、高时间分辨率、高定时稳定性，并能将多指数衰减曲线分解为各个组成部分。其他优势还包括能够记录毫秒级的快速生理效应 FLIM，以及同时记录多个激发和发射波长。

Principles

多光子激发

多光子激发利用两个或多个激发光的光子来激发一个荧光光子，见下图左侧。要使这一过程达到明显的效率，需要极高的空间和时间功率密度。使用飞秒脉冲并通过高纳秒显微镜物镜聚焦，就能实现这两点，见下图（右）。脉冲持续时间为 100 fs，重复频率为 80 MHz，通过 NA = 1.3 的镜头聚焦，不需要超过 5 mW 就能获得显微镜中使用的大多数荧光染料的明亮荧光。在大多数情况下，"多光子 "激发只需使用两个光子。要获得可见光区域的荧光，激光波长必须在近红外（NIR）区域。钛：萨激光器、OPO 和飞秒光纤激光器可用于产生所需的激发波长。

与单光子激发相比，多光子激发有许多优点。
首先，样品在激发波长处的吸收率较低。此外，散射系数也低于可见光或紫外线波长。因此，双光子（或一般情况下的多光子）激发比单光子激发更深入组织，见下图左右两侧。因此，多光子激发可用于激发生物组织深层的荧光。

其次，激发被限制在功率密度较高的焦点体积内。在扫描系统中，这自动意味着激发被限制在焦平面内。这意味着无需共焦针孔来阻挡焦平面以外的光线。多光子激发本质上提供了焦外抑制功能，因此也提供了光学切片能力。
多光子激发不会激发焦平面外的荧光，这一事实带来了多光子激发的第三个优势，即检测样品内部的散射光。来自深焦平面的可见光在流出样品的过程中会发生大量散射，见下图左侧。这种光无法准直，因此无法聚焦到共聚焦针孔中。但是，没有必要通过扫描仪和针孔将光线送回。取而代之的是，光线可以直接从显微镜镜头后方转向探测器。通过投射显微镜镜头的图像（而不是样品中的图像平面），散射光子的大部分会被传送到检测器。这一原理被称为非扫描探测，见下图右侧。

与 bh TCSPC FLIM 系统结合使用的第四个优势是极高的时间分辨率。激发脉冲具有飞秒脉冲宽度。因此，FLIM 系统的仪器响应函数（IRF）不会因激发脉冲而变宽。利用快速混合探测器，IRF 宽度可低至 20 ps (fwhm)。直接记录超快荧光衰减现象的能力为 FLIM 应用开辟了一个全新的领域。请参阅有关蘑菇孢子和花粉粒中的超快衰减及其在亚 10 ps 范围内的测量的应用说明。

Gallery