目录

• 荧光寿命成像显微镜的应用
• 基于 FLIM 的体内成像
• 先进的 FLIM 数据分析
• 您未曾梦想过的领先应用技术

荧光寿命成像显微镜的应用

从一开始，bh荧光寿命成像显微镜 (FLIM)系统的设计就考虑到了生命科学领域的应用。高灵敏度、高光子效率、高时间分辨率、快速记录以及解析多指数衰变函数的能力是这些应用的基本要求。此外，bh 系统还能同时记录多个生物参数，并使其相互影响，从而解决了活体系统的复杂性问题。bh 的多维 TCSPC 技术具有同步 FLIM 和 PLIM、参数控制镶嵌 FLIM、多波长 FLIM 或快速生理效应触发记录等功能，几乎完美地满足了这些需求。这些特点使 bh FLIM 系统超越了市场上的其他系统。

所有这些应用的基础是大多数荧光团的荧光寿命取决于其分子环境。因此，精确测量荧光寿命或更确切地说 FLIM 图像像素中的荧光衰减函数，是获得生物系统可靠信息的关键。FLIM 在这方面的一个固有优势是，在合理范围内，荧光寿命与荧光团浓度、激光功率、探测器增益或其他实验或仪器细节无关。钙浓度测量的示例如右图所示。

尽管 bh FLIM 技术非常适合入门级应用，但它在高级应用中却能充分发挥其威力。

分子成像

分子成像 “包括广泛的应用，如组织、细胞和亚细胞区的 pH 值测量，生理相关离子的浓度，如 Ca⁺+、^Mg++、^Na+、^K+^、Cl- 或氧浓度或葡萄糖浓度。膜电位测量也属于这一类。

代谢成像

代谢成像利用 NAD(P)H 和/或 FAD 的衰变功能来确定细胞和组织的代谢状态。在这里，信息主要不在于荧光寿命，而在于衰变的多指数组成。

FRET 成像

FRET（佛斯特共振能量转移）测量利用从供体分子到受体分子的能量转移来探测蛋白质构象和不同蛋白质之间的相互作用。同样，这里的荧光衰减函数是多指数的，FLIM 技术必须解析复合衰减的参数，才能从数据中提取完整的 FRET 信息。

同时成像 NAD(P)H、FAD 和 pO2

bh 技术可将代谢成像与同步 pO2 成像相结合。有了这种组合，就可以根据氧气浓度来研究细胞的新陈代谢状态。

生物材料中的超快衰变

bh FLIM 系统为在生物和医学成像中使用超快荧光衰减效应开辟了道路。胡萝卜素和黑色素的寿命及其对细胞或组织状态的依赖性在其他 FLIM 系统中仍无法检测到，但 bh FLIM 系统却能轻松记录。

基于 FLIM 的体内成像

荧光寿命成像显微镜（FLIM）方法特别适合于体内诊断，因为它们是非侵入性和非破坏性的。因此，它们被广泛用于临床研究和活体医学检查。下面举例说明。

临床前 FLIM

使用 DC-120 MACRO FLIM 系统可以观察小动物的肿瘤进展情况。下图显示的是一只小鼠的开放性肿瘤。肿瘤组织与正常组织清晰可辨。

皮肤体内诊断

人体皮肤的多光子寿命断层成像采用双光子激发和非扫描检测相结合的方法。多光子 FLIM 可提供深达 100 微米的组织层光学切片图像。对人体皮肤细胞进行活体双光子成像不会影响组织的活力。从 FLIM 图像的 Z 叠图像中可以重建亚细胞分辨率的三维结构。

荧光终生眼科成像（FLIO）

眼科 FLIM 采用快速光束扫描和皮秒二极管激光激发相结合的方法。这种方法非常灵敏，能够记录人眼眼底（背景）的终生图像。通过这种方法，可以及早发现眼部疾病，因为这些疾病往往伴随着眼底的新陈代谢变化。反过来，这些变化又会导致内源性荧光团的荧光衰减参数发生变化。

个性化化疗

针对患者所患的特殊癌症类型，找到最有效的抗癌药物至关重要。不过，癌细胞对不同类型药物的反应并不能完全预测。因此，需要进行活组织切片检查，培养细胞并用不同的药物进行治疗。同时，用 FLIM 对它们进行反复成像。荧光寿命显示了细胞在治疗后新陈代谢状态的早期变化。因此，通过这些测量，只需几天时间就能确定最有效的药物。

先进的 FLIM 数据分析

所有 Becker & Hickl FLIM 系统都使用 SPCImage NG FLIM 数据分析。SPCImage NG 采用单、双或三指数模型拟合图像像素中的衰变数据。拟合过程使用最大似然估计 (MLE) 算法。与传统的加权最小二乘法（WLS）拟合相比，MLE 在每个像素光子数较少的情况下不会出现寿命偏差，并能提供更好的多指数衰变参数分辨率。计算在图形处理器（GPU）上运行 GPU 在大量像素中并行运行数据分析。因此，计算以前所未有的速度进行。以前需要 10 分钟甚至更长计算时间的大型 FLIM 图像，现在只需几秒钟就能完成分析。

SPCImage NG 将时域分析与相位分析相结合。通过 “相位图”，用户可以将衰变特征相似的像素的时间数据合并为一条荧光衰变曲线。这样，就可以从低光子数数据中获得精确的多指数衰变数据。特别是，可以识别大型 FLIM 马赛克数据中的移动物体，合并相应的像素数据，并以前所未有的精度对结果进行分析。

SPCImage 还解决了 FLIM 数据任意衰减分析的一个老问题。衰减分析需要知道记录系统的仪器响应函数（IRF）。在 FLIM 系统中测量 IRF 是困难的，甚至是不可能的。因此，SPCImage NG 通过对 FLIM 数据本身进行多参数分析来确定 IRF。这不仅使 FLIM 系统的使用更加人性化，还避免了因错误测量 IRF 而产生的假象。

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