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分子成像：细胞内发生了什么？

细胞内有多少钙、钠、镁？在哪里？细胞内的 pH 值是多少？两种蛋白质是否相互连接？如果是，有多少是成对连接的，有多少是不连接的？这些参数在细胞区域内是否有变化？细胞膜上的电压是多少？分子成像技术可以解决这些问题。几乎所有能想到的细胞参数都有 "分子探针"。这些探针是根据分子环境改变构型的分子。这些变化会导致量子产率和荧光寿命的改变。另一种探测机制是 FRET（佛斯特共振能量转移）。FRET 对供体和受体之间的距离很敏感。蛋白质结合和蛋白质构型的变化会改变 FRET 的效率，进而导致供体的荧光寿命发生变化。通过 FLIM 测量荧光寿命的变化，就能知道细胞中发生了什么，以及具体发生在哪里。用荧光寿命测量细胞参数比用荧光强度测量细胞参数更可靠：与荧光强度相比，荧光寿命并不取决于探针的浓度、激光强度、滤光片特性和其他仪器参数。

利用 FLIM 进行分子成像需要精确绘制细胞和组织中的荧光寿命图。FLIM 技术应具有高灵敏度，能以最少的记录光子提供荧光寿命的绝对值，并能可靠地解析多指数衰变曲线。此外，应提供足够多的激发波长，以便灵活选择探针，分光镜和滤光器应允许用户选择任何合理的检测波长。这正是 bh 分子荧光成像系统的设计用途。

基本功能

• 全电动样品台
• 4D Z-stack FLIM 视频速率记录准备就绪 - Express FLIM^(*)
• 无缝分析集成，包括相位图 +、按寿命分割图像、FCS 分析
• 区域和线扫描模式，以及用于相关测量的真实点测量。
• 快速激光扫描单元，实现最佳图像采集效果
• 为您的实验选择的基本检测滤波器套件

^(*) 取决于时间标记单元的选择

选项：

• 激光波长选择
• 选择快速高效的 Becker & Hickl 混合型单光子探测器
• 用于活细胞工作的带可选环境控制的培养箱。

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利用 FLIM 进行分子成像

原理

当分子处于激发态时，它可以通过发射光子、内部将能量转化为热量或与其他分子进行能量交换来返回基态。因此，分子停留在激发态的时间（或荧光寿命）取决于荧光团的分子环境。因此，精确测量荧光寿命或更确切地说 FLIM 图像像素中的荧光衰减函数，可用于获取生物系统的可靠信息。FLIM 在这方面的一个固有优势是，在合理范围内，荧光寿命与荧光团浓度、激光功率、探测器增益或其他实验或仪器细节无关。因此，用 FLIM 测量分子参数比强度测量更可靠。

分子 FLIM 技术的要求

分子成像实验当然必须在活细胞或活组织中进行。这意味着从样品中获得的光子率非常有限。因此，高灵敏度和高光子效率（即在检测到的光子数量有限的情况下实现最大信噪比）非常重要。其他要求还包括高时间分辨率、高定时稳定性以及记录和解析多指数衰变曲线的能力。此外，光学切片能力、无横向串扰以及同时记录多个波长间隔的能力也很重要。这些要求正是 bh TCSPC FLIM 技术和 bh TCSPC FLIM 系统的固有特征。

FLIM 测量的分子参数

在大多数情况下，分子成像是通过用一种或几种荧光团孵育或转染样品来实现的，这些荧光团会显示出所需的相关分子参数的依赖性。此类 "分子探针 "种类繁多，请参见W. Becker（编），Advanced TCSPC Applications，Springer 2015。

可通过 FLIM 测量的分子参数包括pH 值、^Na +、^K+、^Ca++、^Mg++、^Hg++、Cl-^、葡萄糖浓度、膜电位、局部粘度、局部温度以及其他多种可用分子探针测量的细胞参数。

FRET 成像

佛斯特共振能量转移（FRET）是两个分子之间的相互作用，其中一个分子的发射带与另一个分子的吸收带重叠。在这种情况下，第一个分子（供体）的能量可以转移到第二个分子（受体）。FRET 可以极其有效地淬灭供体荧光，从而大大降低供体的寿命。

从供体到受体的能量传输率随距离的六次方而降低。因此，只有在距离小于 10 nm 时才会出现这种现象。FRET 被用作研究蛋白质间相互作用和蛋白质构象的工具。在第一种情况下，供体和受体分别标记不同的蛋白质，FRET 用作这些蛋白质之间结合的指标。在第二种情况下，供体和受体附着在同一蛋白质上。FRET 的强度就是蛋白质构象的指标。正确的 FRET 测量需要进行双指数衰减分析，因此无法使用 FLIM 系统进行测量，因为该系统无法记录完整的衰减曲线，请参阅 "基于寿命的 FRET 测量中的常见错误"。双指数 FTET 测量不仅无需外部校准，还能通过一次 FLIM 测量获得经典 FRET 效率、相互作用供体的 FRET 效率、相互作用供体的比例以及供体-受体距离。请参阅 "双指数 FLIM-FRET 方法无需校准"。