NADH 和 FAD 的吸收光谱是重叠的。因此，原则上您可以同时激发这两种分子，例如在 395 nm 处（或多光子激发时在 790 nm 处），即在激发点上没有问题。但是，当两个发射同时发生时，两个发射的分离就会出现问题。请看下图：
请注意，NADH 信号通常比 FAD 信号强得多。当同时激发 NADH/FAD 时，”问题 “出现在蓝色阴影标记区域。两个发射光谱强烈重叠。在您通常选择的 “FAD 通道”（如 540+/-20 纳米）中，NADH 的发射强度通常比实际的 FAD 发射强度高出许多倍。因此，实际上当两个分子同时被激发时，这并不是一个 FAD 通道，而是第二个 NADH 通道。
因此，如果要使用 FAD 信号和 NADH 信号，就需要进行多重激发。