在某些情况下，在SPCImage 中使用建模的 IRF 不会产生令人满意的结果。这种情况通常发生在模型函数与实际 IRF 不太吻合的情况下。如果探测器的 IRF 显示出特殊的形状特征，例如 SPAD 的扩散尾或 MCP 探测器的次级峰，就会出现这种偏差。此外，许多二极管激光器在较高功率下工作时会在 IRF 中产生次峰值。
在上述任何一种情况下，将测量到的 IRF 纳入 FLIM 数据分析都能提供更稳定的结果，并提高不同 IRF 测量系列的一致性。本文介绍了如何从测量数据中提取 IRF 并将其用于SPCImage 中的 FLIM 数据分析。该过程非常简单，只需点击几下即可完成。但是，必须有有效的 IRF 测量值。
简要说明
- 启动 SPCImage 并将带有 IRF 测量值的 .sdt 文件加载到 SPCImage 中：文件 -> 导入
- 选择包含 IRF 数据的曲线像素。增加分档参数，为曲线添加更多光子。
在某些情况下，您也可以使用图标栏中的 “LOCK（锁定）”图标将所有像素分到一起。 - 在衰减视图窗口中，使用黑色光标选择曲线的相关部分。光标以外的所有值都将设为零。
- 选择IRF -> 从衰变数据中复制
现在您应该可以看到，在衰减窗口中，绿线正好覆盖了光标范围内的蓝点（测量数据）。 - 选择IRF -> 复制到剪贴板
- 打开另一个 SPCImage 实例，从您要分析的 .sdt 文件中导入 FLIM 测量数据。
- 选择IRF -> 从剪贴板粘贴
- 现在像往常一样运行 FLIM 分析
要了解更多信息，请继续阅读下文。
长版本
第一步当然是在仪器上测量 IRF。有多种方法可以做到这一点，如测量散射、淬灭荧光、SHG 等。但目前还没有一种适用于所有仪器的通用方法。请参阅bh TCSPC 手册第 446 页的 “IRF 记录 “部分。在本节中，我们假定已经执行了有效的 IRF，并以 .sdt 文件的形式提供。
打开 IRF 测量并提取 IRF
- 启动 SPCImage 并将带有 IRF 测量值的 .sdt 文件加载到 SPCImage 中：文件 -> 导入
- 选择包含 IRF 数据的曲线像素。增加分档参数，为曲线添加更多光子。
- 在某些情况下，您也可以使用图标栏中的 “LOCK（锁定）”图标将所有像素分到一起。
- 在衰减视图窗口中，使用黑色光标选择曲线的相关部分。光标以外的所有值都将设为零。
在下面的示例中，在双光子 FLIM 显微镜上记录了尿素晶体的 SHG 信号。增加分档后，可以看到一个主峰和几个由寄生反射产生的微弱次峰。我们使用衰减视图窗口中的黑色光标来分离出主峰，并将其用作 IRF。 请注意，在此阶段 SPCImage 并不知道我们的计划。SPCImage 仍会尝试模拟合成 IRF（绿线），并用荧光衰减模型（红线）拟合 SHG 数据。
使用黑色光标选择正确范围后，我们需要告诉 SPCImage，它应将测量数据（蓝点）声明为 IRF。为此，我们可以在菜单栏中告诉 SPCImage 从测量数据中提取 IRF：
4.选择IRF -> 从衰减数据中复制
现在您应该可以看到，在衰减窗口中，绿线正好与光标范围内的蓝点（测量数据）重叠。请注意，现在 SPCImage 会自动尝试用新的 IRF 拟合数据，并在模型选项中设置最低寿命值。
最后一步，我们需要将新的 IRF 复制到剪贴板：
5. 选择：IRF -> 复制到剪贴板
现在 IRF 数据已在剪贴板中，可以粘贴到任何地方（详情见下文）。
在实际 FLIM 测量中使用 IRF
要将提取的 IRF 纳入实际分析，我们需要加载 FLIM 数据集并粘贴 IRF。通常，我们会启动另一个 SPCImage 实例，并导入包含 FLIM 测量数据的 .sdt 文件： 文件 -> 导入
现在将剪贴板中的 IRF 粘贴到当前数据集中：
7.选择：IRF -> 从剪贴板粘贴
现在像往常一样运行 FLIM 分析。新的 IRF 将用于拟合荧光衰减曲线。
提示和技巧
由于 SPCImage 使用剪贴板来存储 IRF，而且数据格式只是光子数的矢量，因此很容易 “玩转 “IRF。还可以使用自己的模型函数来查看分析效果。
随心所欲……
将 IRF 复制到计算机的剪贴板后，可以轻松粘贴到任何其他软件中。例如，在记事本中粘贴并检查数据：
数据格式由整数值组成，以列矢量形式排列。条目数等于荧光衰减曲线的点数，即 SPCM 中的 ADC 分辨率。在这里，您只需手动更改数值（保留整数格式和行数），然后复制粘贴回 SPCImage 即可。 如果您想记录尝试过的不同 IRF，或者想将其导入其他软件，可以将数据保存为简单的文本文件。
如果您使用 Matlab，则可以在变量编辑器中轻松粘贴数据。首先在命令行中创建一个新变量：
IRF=0；
然后在变量编辑器中打开变量，粘贴之前在 SPCImage 中复制的数据：
……中复制的数据。
如果在其他软件中修改过 IRF 或对其进行过建模，则可以通过选择从剪贴板粘贴到 SPCImage 中： IRF -> 从剪贴板粘贴
唯一需要注意的是：值必须是整数值（无逗号、无点），矢量的长度必须与当前数据集相匹配。最佳做法是从 SPCImage 中复制建模的 IRF，并将其用作比较或模板。