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荧光相关光谱 (FCS) – 如何在显微镜中使用
荧光相关光谱 (FCS) 的原理是激发飞升体积中的少量分子，检测荧光光子，并将荧光强度的波动关联起来。波动是由扩散、旋转、系统间交叉、构象变化或其他随机效应引起的。这项技术可以追溯到马格德、埃尔森和韦伯在 1972 年发表的一项研究成果。
所需的飞摩尔检测体积只能在高纳显微镜镜头的聚焦范围内实现。因此，FCS 测量必须在显微镜或类似的光学装置中进行。通过共焦检测或双光子激发，可以从足够小的体积中进行激发和检测。原理与激光扫描显微镜相同，见下图。
利用 TCSPC 模块和 SPCM 软件进行荧光相关光谱分析的强大功能
探测器发出的单光子脉冲由 TCSPC 模块以先进先出（参数标记）模式记录。在有多个探测器的设置中，探测器的光子脉冲或者通过路由器连接到一个 TCSP 模块，或者连接到单独的 TCSPC 模块。相关函数由 SPCM 软件在线计算。有关相关算法，请参阅bh TCSPC 手册“荧光相关光谱 “一章。
下图所示为集成在 DCS-120 共焦 FLIM 系统中的 bh SPC-150 模块记录的 FCS 曲线。使用ps二极管激光器进行激发，因此可同时获得荧光衰减曲线和 FCS 曲线。图中显示的是典型 FCS 配置下的 SPCM 软件主面板。左侧显示衰减曲线，右侧显示 FCS 曲线。底部显示波动强度轨迹。有关程序和参数设置，请参阅手册 “DCS-120 共焦和多光子 FLIM 系统“。
利用时间门控增强 FCS：示例图
TCSPC 数据包含光子的宏观时间（绝对时间）和微观时间（激光脉冲后的时间），这一事实可用于对 FCS 记录进行时间门控。当荧光分子的荧光信号被溶剂的拉曼散射污染时，时间门控很有帮助。下图是一个例子。左图数据包含拉曼峰，右图数据则关闭了拉曼峰。由于选通信号不包含拉曼信号，因此 FCS 振幅大幅增加。
更多信息、相关应用和参考文献，请参见bh TCSPC 手册，”荧光相关光谱 “一章