利用 FLIM 进行代谢成像

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利用 NAD(P)H 和 FAD FLIM 进行代谢成像

NAD(P)H（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和 FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）是参与细胞代谢的辅酶。NAD(P)H 和 FAD 都有荧光。FAD 尤其是 NAD(P)H 的独特之处在于，它们的荧光强度和荧光衰减函数可以直接反映细胞的新陈代谢状态：NAD(P)H 和 FAD 的荧光寿命取决于与蛋白质的结合情况。未结合的 NAD(P)H 的荧光寿命约为 0.3 至 0.4 毫微秒。结合的 NAD(P)H 的荧光寿命约为 1.2 ns [9]。对于 FAD 来说，结合的效果正好相反：结合的 FAD 的寿命为几百 ps，未结合的 FAD 的寿命为几 ns。

NAD(P)H 和 FAD 的衰变函数组成

重要的是，结合和未结合的 NAD(P)H 以及结合和未结合的 FAD 的数量比例取决于新陈代谢的类型。从糖酵解到氧化磷酸化或从氧化磷酸化到糖酵解，都会导致非结合/结合比率的变化：糖酵解产生的 NAD(P)H 的 a1/a2 高，而 FAD 的 a1/a2 低；氧化磷酸化产生的 NAD(P)H 的 a1/a2 低，而 FAD 的 a1/a2 高。 结合/非结合比率直接反映了 “沃伯格效应”：在正常细胞中，氧化磷酸化占主导地位，而在癌细胞中，还原糖酵解占主导地位。因此，正常细胞和癌细胞可以通过 a1/a2 比率或仅通过 a1（因为 a1+a2= 1）来区分。需要注意的是，a1 或 a1/a2 的变化也隐含在幅度加权寿命 tm 和强度加权寿命 ti 中。然而，衰变成分本身的寿命受其他分子环境参数（如线粒体 pH 值）的影响。因此，寿命不能作为绝对的鉴别参数。

激发和发射波长

NAD(P)H 和 FAD 的近似激发和发射光谱如下图所示。从图中可以看出，只有使用不同的激发波长和不同的检测波长，才能将 NAD(P)H 和 FAD 的荧光信号区分开来。

NAD(P)H 和 FAD 的激发光谱和发射光谱

NADH 适合的单光子激发波长为 350 至 375 nm，FAD 适合的单光子激发波长为 405 至 420 nm。双光子激发波长分别为 750 纳米和 920 纳米。NAD(P)H 的检测波长间隔约为 425 至 475 nm，FAD 的检测波长间隔约为 475 至 600 nm。

同时测量 NAD(P)H 和 FAD

为了最大限度地减少光漂白、聚焦漂移和可能的生理变化的影响，最好能准同时记录 NAD(P)H 和 FAD 的 FLIM 数据。这可以通过激光复用和复用 TCSPC 来实现：激光与扫描仪同步复用，或逐行复用，或逐帧复用。两个平行的 FLIM 通道记录两个发射波长区间的信号。所有所需的功能都在bh DCS-120 共焦扫描 FLIM 系统中实现。因此，使用 DCS-120进行代谢 FLIM 只需使用正确的激光器和选择正确的设置参数。如果使用正确的激光器并为多路复用做好准备，原则上也可以使用与其他激光扫描显微镜相连的bh FLIM 系统进行代谢FLIM。

典型结果

下图是使用DCS-120 系统和波长分别为 375 nm 和 405 nm 的BDL-SMN 激光器记录的图像。激光逐帧复用，图像记录在DCS-120 系统的两个通道中。

正常细胞（左）和肿瘤细胞（右）的 NAD(P)H a1 图像。下行a1 在图像像素上的直方图。
正常细胞（左）和肿瘤细胞（右）的 FAD a1 图像。下一行：a1 在图像像素上的直方图。

上述数据表明，正常细胞和肿瘤细胞在 NAD(P)H 和 FAD 图像中的快速衰变分量 a1 的振幅分布是不同的。更多信息，请参阅bh TCSPC 手册和应用说明 “使用 DCS-120 共焦 FLIM 系统进行代谢成像”：NAD(P)H 和 FAD 的同步 FLIM”。

References

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Products

用于尼康 A1 / C1 / C2 的 FLIM 系统

用于尼康 A1+ 的 FLIM 系统

用于奥林巴斯 FV1000 的 FLIM 系统

用于 Leica SP2 / SP5 / SP8 的 FLIM 系统

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