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Principles
了解反束缚：它在量子点和单分子中的工作原理
反束缚 “是指光子出现的时间比传统光信号更有规律。在传统光源发出的光信号中，例如黑体的热发射或大量分子发出的荧光，光子的发射时间是随机的。而单个发光体（如单个分子或量子点）发出的荧光则不一定如此。单个发射体被激发后，在从激发态返回之前不能再被激发（并发出第二个光子）。这意味着，随着光子之间的间隔时间比激发态寿命更短，发射多个光子的可能性越来越小。
汉伯里-布朗-特维斯实验：利用 TCSPC 测量反束缚效应
在经典的 Hanbury-Brown-Twiss 实验[1]中，TCSPC 可以测量反束缚效应。原理如下图所示。被研究的光信号由一个 1:1 的分光器分割，两个光信号分别输入不同的探测器。一个探测器提供TCSPC 设备的启动脉冲，另一个提供停止脉冲。停止脉冲延迟几毫微秒，以便将重合点置于记录时间间隔的中心[4]。该装置可提供两个探测器的光子时间差直方图。直方图在重合点处有一个凹陷。凹陷的深度取决于观测体积中独立发射体的数量；凹陷的形状取决于激发态的寿命 [2，3]。
CW 激发中的反束缚：汉伯里-布朗-特维斯实验的启示
汉伯里-布朗-特维斯实验可以在连续波激励或脉冲激励下进行。下图所示为使用 CW 激发记录的抗冲击曲线。该曲线由DCS-120 共焦 FLIM 系统记录[5]。该系统的两个探测器分别连接到两个 SPC-150 模块之一的启动和停止（CFD 和 SYNC）输入端。停止信号延迟了 5 米电缆，即 25 毫微秒。样品为稀释的荧光素溶液。样品在 488 nm 波长下被激发，激光器切换到 CW 模式。
脉冲激发和反捆绑：探索相关峰值
使用脉冲激发进行汉伯里-布朗-特维斯实验时，结果显示出多个相关峰，其间距与激发脉冲的周期相同。如果出现反捆绑现象，中心相关峰的振幅就会变小。超短脉冲最能观察到这种效果。被一个脉冲激发的分子不太可能发出光子，也不太可能再次被相同的脉冲激发。振幅的减小取决于观测范围内独立发射体的数量。如果一次只有一个发射器，振幅就会变为零。
mNeonGreen 作为单个发射器：不同浓度下的反捆绑曲线
下图是一个例子。一种名为 mNeonGreen 的荧光蛋白通过 Ti:Sa 激光器进行双光子激发。光子由两个HPM-100-40 混合探测器检测，并由 SPC-150 TCSPC 模块记录。图中显示了两种不同浓度下的曲线。在低浓度下，中心峰消失，这表明 mNeonGreen 是单发射体。
参考文献
- 汉伯里-布朗，R.Q. 特维斯，两束相干光中光子的相关性，《自然》177，27-29（1956 年）
- 保罗，《现代物理学评论》，54 (4)，1061-1102 (1982)
- Basché、W.E. Moerner、M. Orrit、H. Talon，困在固体中的单个染料分子荧光中的光子反束，《物理评论快报》，69, 1516 (1992)69, 1516 (1992)
- Becker,The bh TCSPC Handbook.见 www.becker-hickl.com
- Becker & Hickl GmbH，DCS-120 共焦和多光子 FLIM 系统，用户手册。见 www.becker-hickl.com