通过 FLIM 进行 FRET 成像

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佛斯特共振能量转移 (FRET) – 探索蛋白质与蛋白质之间的相互作用

佛斯特共振能量转移（FRET）是两个分子之间的相互作用，其中一个分子的发射带与另一个分子的吸收带重叠。在这种情况下，第一个分子（供体）的能量可以转移到第二个分子（受体）。FRET 可以极其有效地淬灭供体荧光，从而大大降低供体的寿命。从供体到受体的能量传输率随距离的六次方而降低。因此，只有在距离小于 10 纳米时，这种现象才会明显。FRET 被用作研究蛋白质间相互作用的工具。供体和受体分别标记不同的蛋白质，FRET 用作这些蛋白质之间结合的指标。FRET 是最常见的FLIM应用。

佛斯特共振能量转移（FRET）的原理

由于其对距离的依赖性，FRET 已成为细胞生物学的重要工具。用供体和受体标记不同的蛋白质；然后利用 FRET 验证蛋白质是否存在物理连接，并确定纳米级的距离。

利用 FLIM-FRET了解蛋白质相互作用：如何解读数据和可视化结果

FLIM-FRET 数据的解读很简单：在没有 FRET 的情况下，供体的寿命保持不变。当存在 FRET 时，供体会将其激发能量释放到受体中，因此寿命会缩短，见下图。

利用 FRET 进行蛋白质相互作用实验。当蛋白质相互作用时，会发生 FRET，供体的荧光寿命会缩短。

使用FLIM进行 FRET 有一个明显的好处，即可以从供体的单个寿命图像中获得 FRET 强度。发生 FRET 时，供体的荧光寿命会缩短，而没有 FRET 时，供体的荧光寿命保持不变。检测蛋白质相互作用所需的就是供体的单个荧光寿命图像。因此，供体渗漏和直接激发的受体荧光对 FLIM-FRET 测量没有影响。下图是一个例子。

细胞膜上有相互作用蛋白质的细胞 FRET 图像

双指数 FLIM-FRET 分析 – 精确测量距离

在所有蛋白质相互作用实验中，通常存在相互作用蛋白质和非相互作用蛋白质的混合物。相互作用蛋白质的比例和蛋白质之间的距离都会影响从强度得出的净 FRET 效率。因此，无法判断 FRET 效率的变化是由于距离的变化还是由于相互作用蛋白质比例的变化。

TCSPC FLIM 通过双指数寿命分析解决了相互作用和非相互作用供体的问题。由此得出的供体衰变函数可近似为双指数模型，其中快速部分来自相互作用的供体分子，慢速寿命部分来自非相互作用的供体分子。供体不相互作用有多种原因。蛋白质可能只是没有相互连接，受体蛋白质可能没有被受体标记，或者供体和受体之间的方向可能是错误的。方向通常被认为是随机的，并通过κ2因子加以考虑。如果细胞表达的是 GFP 变体的融合蛋白，那么衰减分量代表了相互作用和非相互作用供体分子的比例。经κ2 校正后，振幅 a 和 b 代表相互作用和非相互作用蛋白质分子的比例。供体衰变函数的组成如下图所示。

相互作用和非相互作用蛋白质的混合物会产生双指数供体衰变函数。双指数衰变分析将相互作用和非相互作用的供体部分分开。

下图显示了双指数 FLIM-FRET 分析的结果。左图显示了非相互作用和相互作用供体部分的寿命比t0/ tfret。最左侧显示的是t0/tfret 在不同区域的分布情况。最大值的位置仅相差 10%，相当于约 2%的距离变化。然而，强度系数 a/b 以及相互作用蛋白质的比率Nfret/N0的变化约为 10:1。

双指数 FRET 分析。左图：非相互作用和相互作用供体的寿命比。右图相互作用和非相互作用供体的数量比。

结果清楚地表明，单指数寿命的变化几乎完全是由相互作用蛋白质比例的变化引起的，而不是由供体-受体距离的变化引起的。换句话说，将单指数寿命的变化（或稳态实验中经典的 FRET 效率！）解释为距离变化会导致错误的结论。因此，双指数 FRET 分析是向定量 FRET 实验迈出的重要一步。

欲了解更多信息和参考文献，请参阅bh TCSPC Handbook，Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 一章。

References

FRET 成像参考文献

有关 FLIM-FRET 的更多参考资料，请参阅 bh TCSPC 手册 “Förster Resonance Energy Transfer (FRET) “一章。

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Products

用于尼康 A1 / C1 / C2 的 FLIM 系统

用于尼康 A1+ 的 FLIM 系统

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