用于超高时间分辨率单光子计数的 TCSPC 设备
在 TCSPC 和 TCSPC FLIM 领域拥有超过 25 年的经验 - 作为技术领导者，Becker & Hickl 提供具有前所未有的时间分辨率的 TCSPC 设备。SPC 模块可用于经典和多维荧光衰减应用，以及荧光寿命成像 (FLIM)、多波长 FLIM、同步荧光和磷光寿命成像 (FLIM / PLIM)、快速时间序列 FLIM、荧光相关光谱 (FCS)、单分子实验、反捆绑实验 (HBT) 和许多其他多维光子记录任务。
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| SPC-180N SPC-180NX SPC-180NXX |
SPC-QC-104 | ||||
| 接口 | PCIe | PCIe | PCIe | PCIe | PCIe |
| 每个模块的 TCSPC 通道 | 1 | 3 (4) | 3 (4) | 7 (8) | |
| 用于 |
氟。衰减 |
氟衰减 近红外 Phot.相关 Sing.分子 FCS |
氟衰变 FLIM, PLIM Phot.Correl. Sing.Molec.FCS |
氟衰减 近红外 Phot.相关 Sing.分子 FCS |
氟衰减 近红外 Phot.相关 Sing.分子 FCS |
|
定时精度（抖动，有效值） |
2.5 ps |
2.5 ps 1.6 ps 1.1 ps |
16 ps（典型值） | 16 ps（典型值） | 14 ps（典型值） |
| 定时精度/√2(5) |
1.8 ps |
1.8 ps 1.1 ps 0.8 ps |
11 ps | 11 ps | 9.9 ps |
| 最小值分区宽度 | 813 帧 405 fs 203 fs |
813 fs 405 fs 203 fs |
4 ps | 4 ps | 1 ps |
| Abs.定时稳定性（有效值） | <0.5 ps | <5 ps | <5 ps | <5 ps | |
|
一般记录模式 |
经典 TCSPC、FLIM、FCS、 |
经典 TCSPC、FCS、HBT(4)、 时间标签 |
经典 TCSPC，FLIM，FCS、 HBT（4），时间标签 |
经典 TCSPC、FCS、HBT（4）、 时间标签 |
经典 TCSPC、FCS、HBT（4）、 时间标签 |
| 每个通道检测器 | 最多 16(1) | 最多 16(1) | 最多 16(1) | 1 | |
| 并行模块 | 最多 4(2)或 32(3 ) | 1 | 1 | 最多 4 个 | |
| 多模块封装 | SPC-182N SPC-183N SPC-184N |
SPC-132IN SPC-133IN SPC-134IN |
– | – | – |
(1) SPC 系列的所有模块：使用路由器 HRT-41 或 HRT-81 最多可连接 4 或 8 个 PMT；使用 HRT-82 最多可连接 8 个 SPAD（TTL）。16 通道检测由 PML-16 检测器系列提供。
(2) SPCM 软件的单个实例最多可操作四个模块。可以启动多个 SPCM 实例来操作四个以上的模块或不同类型的模块。
(3) 使用 SPCM DLL 和自定义编程，最多可并行操作 32 个模块。
(4) Hanbury-Brown-Twiss 设置。两个探测器之间的起止直方图。
(5) 通道定时的标准偏差 σ 和 FWHM 始终在两个通道之间测量。为便于与其他产品进行比较，假定抖动分布为高斯分布，则单个信道事件定时的抖动可估算为 σ/√2。FWHM 也作相应处理。
SPC-130IN 系列
SPC-130IN、SPC-130INX、SPC-130INXX TCSPC 模块SPC-QC-104 模块
3 通道 TCSPC - FLIM 模块 / 4 通道时间标记模块SPC-QC-004 模块
3 通道 TCSPC 模块 / 4 通道时间标记模块SPC-QC-008 模块NEW
7 通道 TCSPC 模块 / 8 通道时间标记模块PMS-800NEW
门控光子计数器Are you looking for documentation of former products? Please check Discontinued Products
TCSPC 和 TCSPC FLIM 的技术术语
TCSPC – 时间相关单光子计数
TCSPC通过检测重复光信号的单光子，确定光子在参考（或激发）脉冲之后的时间，并建立光子在参考脉冲之后时间内的分布，从而记录重复光信号的时间曲线。最常见的应用是记录荧光衰减函数。TCSPC 具有极高的时间分辨率和接近理想的光子效率和灵敏度。另请参阅 “多维 TCSPC”。
多维 TCSPC
经典 TCSPC 技术的扩展。多维 TCSPC检测重复光信号的单光子，并确定参考（或激发）脉冲后的光子时间以及光子的一个或多个其他参数。这些参数可以是波长、光子在样品中发射的空间位置、样品受到激励后的时间，或与光子相关的任何其他参数。例如多波长 TCSPC、荧光寿命成像 (FLIM)、磷光寿命成像 (PLIM)、时间序列 FLIM 或这些技术的组合。
多波长 TCSPC
一种多维 TCSPC 技术，光子的第二个参数是波长。多波长 TCSPC 可同时建立不同波长的多条（目前的 bh 检测器最多可建立 16 条）荧光衰减曲线。请注意，多波长 TCSPC 并非基于波长扫描。所有波长的光子都会同时被检测到，并被导入光子分布的不同衰减曲线中。
FLIM – 参见 TCSPC FLIM
TCSPC FLIM – 基于 TCSPC 的荧光寿命成像
TCSPC FLIM使用高频脉冲激光束扫描样品，检测荧光的单光子，并根据激发脉冲后的光子时间和扫描区域的坐标建立光子分布。请注意，这不是一个逐像素的过程。当检测到一个光子时，它只是被放置在与光子检测时刻激光束位置相对应的像素中，以及与激发脉冲期间光子时间相对应的时间通道中。因此，TCSPC FLIM 可以在任何扫描速率下工作。FLIM 是多维 TCSPC 最常见的应用。TCSPC FLIM 提供一个像素阵列，每个像素包含一条由大量时间通道组成的荧光衰减曲线。该技术具有极高的时间分辨率和接近理想的光子效率。通过重复扫描，结果的信噪比仅取决于光子速率和总采集时间。FLIM 可用作显微镜对比技术，但大多数 FLIM 应用的目的是分子成像，即通过其对荧光衰减函数的影响来确定分子参数。TCSPC FLIM 于 1996 年由 bh 公司推出。首次应用是在荧光终身成像眼底镜（FLIO）中。随后于 1999 年应用于激光扫描显微镜。
扫描
TCSPC FLIM 采用扫描方式。虽然扫描使光学系统比宽视场系统更复杂，但它也有很大的优势。由于每次只激发一个像素，因此不会产生来自其他像素的散射光。因此，即使不借助共焦检测或多光子激发，仅扫描就能获得比宽视场成像好得多的图像对比度。
FLIO– 荧光寿命成像眼底镜
人眼的临床荧光寿命成像。视网膜的荧光寿命图像可显示新陈代谢变化的早期迹象。因此，它们可用于发现眼部疾病的早期阶段，以免对眼睛造成永久性伤害。
共焦 FLIM
TCSPC FLIM 使用共焦系统扫描样品。样品通过物镜与聚焦激光束进行扫描。物镜收集荧光光子，并将其投射到与样品共轭平面上的针孔中。通过针孔的光子由 TCSPC FLIM 记录。共焦检测可抑制焦外信号和散射光，从而获得焦平面的清晰终生图像。
多光子 FLIM
用近红外飞秒激光束通过物镜扫描样品。通过多光子（通常是双光子）过程进行激发。激发只发生在焦平面。因此不需要针孔来剔除焦外荧光。物镜收集到的光子直接（无需针孔）传输到 FLIM 检测器。这一原理被称为 “非扫描检测“或 “NDD”。寿命图像的建立是通过通常的 TCSPC FLIM 过程完成的。多光子成像技术的优势在于，近红外光可以到达样品的深层。此外，即使光子在离开样品的过程中发生散射，NDD 光束路径也能将光子传送到检测器。因此，多光子 FLIM 能够提供深层样品平面的清晰图像。
IRF – 仪器响应函数
IRF是 TCSPC 系统通过直接观察激发激光束而记录的时间曲线，中间不夹杂样品。bh TCSPC 设备目前的 IRF 宽度（半最大全宽） 为：快速混合探测器 18 ps，快速 SPAD 9 ps ，快速 超导单光子探测器(SSPD)4.4 ps。
电 IRF
电 IRF是 TCSPC 设备在将定义的电脉冲应用于其输入（探测器和同步）时记录的时间曲线。bh TCSPC 模块的电气 IRF 宽度介于 <3 ps 至约 6 ps（半最大全宽）之间。
IRF 宽度
TCSPC 系统的 IRF 宽度有不同的定义。它可以是整个 TCSPC 系统（包括激光器、探测器和 TCSPC 器件）的 IRF 宽度，也可以是 TCSPC 器件的 IRF 宽度。在第一种情况下，它是系统 IRF，在第二种情况下，它是电气 IRF。其次，IRF 宽度有两种定义。正确地说，IRF 宽度应为 “FWHM”，即 “半最大全宽”。然而，为了指定较低的 IRF 宽度，越来越多的制造商倾向于用 “RMS “或 “均方根 “来表示 IRF 宽度。这个值不是 IRF 宽度，而是检测到的光子的平均定时抖动。RMS 定时抖动比 IRF 的 FWHM 小 2 到 3 倍。
时间分辨率
没有任何参数能像 TCSPC 的 “时间分辨率 “一样定义得如此模糊。它可以是电气 IRF 宽度的 FWHM、系统 IRF 的 FWHM 或电气 IRF 或系统 IRF 的均方根定时抖动。为了争夺时间分辨率，制造商甚至将时间通道宽度称为 “时间分辨率”。时间通道宽度并不能说明真正的时间分辨率。将其指定为 “时间分辨率 “纯粹是为了竞争。最后，”时间分辨率 “可以是系统通过去卷积化所能分辨的最小荧光衰减时间。这种分辨率或多或少是假设的，不应用于生命探测系统的比较。
时间通道宽度
时间通道宽度是收集光子的时间通道的宽度。该参数通常被错误地称为 “时间分辨率”。时间通道宽度必须足够小，以便正确分辨信号的时间形状，但通常没有必要将其减小到系统 IRF 的 FWHM 的 1/10 或信号中最快衰变分量寿命的 1/10。bh TCSPC 模块的时间通道宽度可达 200 飞秒。即使是使用快速 SSPD 检测到的信号，也能有效分辨。
定时稳定性
时间稳定性对于 TCSPC 和 TCSPC FLIM 实验获得可重现的结果非常重要。bh TCSPC 设备的定时稳定性在亚皮秒范围内。只有 bh 为其 TCSPC 和 TCSPC FLIM 设备指定了定时稳定性。
死区时间
死区时间是 TCSPC 器件处理一个光子所需的时间。如果在这段时间内检测到另一个光子，则该光子将被忽略。死区时间会导致强度标度的非线性，但不一定会导致记录的荧光衰减曲线出现错误。
计数损失
记录光子后的死区时间（信号处理时间）内光子的损失。计数损失会导致 TCSPC 和 TCSPC FLIM 的强度标度出现非线性，但不会导致记录的衰减曲线出现误差。
饱和计数率
除非计数率受到读出速度的限制，否则饱和计数率就是死区时间的倒数。它是 TCSPC 设备在输入无限高光子率时所能达到的计数率。TCSPC 设备可以合理地运行到饱和计数率的 50%。
堆积
当 TCSPC 系统的检测器在与前一个光子相同的信号周期内检测到第二个光子时，就会出现堆积现象。第二个光子随即丢失。与计数损失相反，堆积会导致记录的衰变曲线失真。这种影响随着计数率与脉冲重复率之比的增加而增大。在早期使用闪光灯激发的 TCSPC 实验中，堆积是一个真正的问题。而现在的高重复率激光光源则很少出现这种问题。关于堆积效应的大小有一个常见的误解：它比人们通常认为的要小 100 倍。人们经常提到的 “堆积极限 “为激发脉冲速率的 0.1%，这是错误的。真正的堆积极限是激发脉冲速率 10%的光子速率。对堆积效应大小的错误估计导致了许多不必要的技术尝试，这些尝试往往效率低下，无法开发出无堆积效应的荧光寿命检测原理。
暗计数率
暗计数率是指探测器在其有效区域没有光存在时的脉冲速率。暗计数源于 PMT、HPD 或 MCP 光阴极的热发射，或 SPAD 耗尽层内电子-空穴对的热生成。因此，可以通过冷却来降低暗计数率。在 TCSPC 和 TCSPC FLIM 结果中，暗计数会导致记录的衰变函数基线发生偏移。不过，暗计数的偏移通常远小于后脉冲的偏移，见下文。因此，冷却探测器并不总是会产生预期的效果。
后脉冲
后脉冲是指探测器在检测到光子后的最初几微秒内产生假脉冲的趋势。在 PMT 中，后脉冲是由真空管中其余气体原子的电离引起的。在 SPAD 中，后脉冲是由前一个光子的载流子雪崩后残留的滞留载流子引起的。在高重复率 TCSPC 应用中，多个激发周期的光子产生的后脉冲相加，形成一个巨大的计数背景。因此，后脉冲背景可能远高于暗计数背景。后脉冲不能通过冷却来减少。避免后脉冲的最佳方法是使用混合探测器。混合光子探测器（HPD、HPM）没有后脉冲，因为每个光子只有一个电子在真空中移动。
信噪比（SNR
记录光信号时，信噪比受限于所记录光子数的平方根。这一规则既适用于记录的强度，也适用于记录的荧光寿命。提高信噪比的唯一方法就是记录更多的光子，可以通过延长采集时间、提高探测器输入端的光子速率，或者使用探测量子效率更高的探测器。在 FLIM 中，可以通过减少像素数量来提高单个像素寿命的信噪比。对于给定的光子率和给定的采集时间，每个像素的光子数会相应增加。然而，减少像素数量会牺牲空间分辨率。在FLIM 数据分析中，通常通过重叠分档获得更好的结果。
探测效率
检测效率是指 TCSPC 系统检测（和记录）光子的效率。检测效率 “一词有不同的用法。它可以是探测器光输入端的光子在输出端产生有用电脉冲的概率，也可以是 TCSPC 设备记录光子的概率，还可以是样品发射的光子被记录的概率。在最后一种情况下，”探测效率 “包括光子被光学系统收集、通过滤光片、透镜和反射镜系统或光纤以及投射到探测器有效区域的概率。光学系统的效率在 FLIM 中尤为重要。光子是各向同性发射的，因此效率随物镜数值孔径的平方而增加。
光子效率
光子效率描述了寿命检测技术要达到给定的信噪比需要检测多少光子。它的定义是达到该信噪比理论上需要的光子数除以实际需要的光子数。如果测量条件选择正确，TCSPC 和 TCSPC FLIM 的光子效率为 1。如果系统的 IRF 太长，如果信号被后脉冲或暗计数的背景污染，如果荧光衰减不完全在记录时间间隔内，光子效率就会降低。
采集时间
没有什么参数比 TCSPC 和 TCSPC FLIM 的采集时间更容易引起争议了。在早期的 TCSPC 系统中，激发脉冲速率约为 10 kHz。因此，有用光子率受到堆积的限制，采集时间也非常长。现在，重复频率在 50 到 80 MHz 范围内的激励源已经克服了堆积问题。因此，采集时间取决于对结果信噪比的期望、可从样品中获得的光子率、检测效率，在 FLIM 中，还取决于寿命分析中的像素数和分选因子。根据所需的信噪比，当今的 TCSPC 设备可在几毫秒到几十秒内记录荧光衰减曲线，而 FLIM 则可在几分之一秒到几分钟内记录荧光衰减曲线。一个普遍的误解是，”更快 “的 TCSPC 模块（死区时间更短）会缩短采集时间。然而，除非 TCSPC 输入端的脉冲速率高于或可以高于死区时间的倒数，否则情况并非如此。特别是对于生物样品，从样品中获得的计数率是有限的，不会高于普通 TCSPC / FLIM 模块所能处理的计数率。
DNL – 差分非线性
DNL 是指 TCSPC / FLIM 模块中时间转换的时间通道宽度的均匀性。时间通道宽度不均匀会导致光子数在后续时间通道中的分布不均匀。因此，DNL 会在记录的信号形状中引入噪声。DNL 是早期 TCSPC 设备存在的一个问题，但 bh 公司于 1993 年推出的新 TAC/ADC 原理在很大程度上克服了这一问题。实际上，光子脉冲和同步信号之间的电子串扰更有可能导致 DNL 误差，而非 TCSPC 模块内部的 DNL。
通道不均匀性 – 参见 DNL
抖动
一种改善 TAC-ADC 组合的 DNL 而非 ADC 的 DNL 的方法。TAC 的输出信号从一个光子到另一个光子略微偏移，以便在 ADC 特性的不同位置进行时间测量。之后，再从 ADC 信号中以数字方式减去偏移量，以确保电子 IRF 不被扩大。1993 年由 bh 引入，是 bh 快速 TAC-ADC 计时原理的基础。
CFD – 恒定分辨器
大多数单光子探测器发出的光子脉冲都有相当大的振幅抖动。必须避免振幅抖动在 TCSPC 设备的鉴别器中引起定时抖动。因此，TCSPC 采用了 “恒定分数鉴别器”。这意味着当脉冲达到其全振幅的一个给定分数时，鉴别器就会触发。从技术上讲，这是通过重新塑造光子脉冲使其呈现双极形状来实现的。零交叉点的时间位置与脉冲幅度无关。通过在零交叉点上触发，可以在很大程度上避免振幅引起的定时抖动。
TAC – 时间振幅转换器
TAC 将启动脉冲和停止脉冲之间的时间差转换为电脉冲的振幅。然后由模数转换器 (ADC) 将振幅转换为数字起止时间。数字起始-停止时间决定了当前光子加入的时间通道。TAC-ADC 原理是 TCSPC 最古老的时间转换原理。基于 TAC-ADC 原理的 bh TCSPC 模块的电气 IRF 宽度小于 2 ps，RMS 时间抖动小于 1 ps。时间通道宽度可小至 200 飞秒。目前还没有其他 TCSPC 模块能达到如此高的分辨率。
TDC – 时间数字转换器
TDC 通过将事件（在 TCSPC 中通常是光子的检测）发送到一连串逻辑门来测量事件的时间。光子脉冲通过一个延迟链，同步脉冲通过另一个延迟链，从而确定光子与同步脉冲之间的时间。电子 IRF 宽度通常为 40 ps 至 80 ps，最小时间通道宽度为几皮秒。TDC 原理的一个优点是可以很容易地在一块 TCSPC 电路板上实现多个定时通道。bhSPC-QC-104 模块就采用了这一原理。
并行计数器通道
最新的 bh TCSPC FLIM 模块有一个与定时电路并行的计数器通道。计数器对光子进行计数，几乎没有死区时间。利用定时电路的光子时间和并行计数器的光子数，就能获得具有线性强度标度的 FLIM 图像。
PMT – 光电倍增管
PMT 是一种光子计数探测器，带有一个光电阴极和若干放大级（或称 dynode）。光电子从光电阴极被加速到第一个 dynode。光电子在此产生若干个次级电子，这些次级电子又被加速到下一个放大级，在此产生更多的电子。PMT 有五到九个动态节点，倍增因子高达107。因此，单个光子可提供数毫安的可检测输出脉冲。
HPD – 混合光电探测器
光电子在光电阴极产生，并向硅雪崩二极管加速。当光电子击中二极管时，会产生数千个电子-空穴对。这些对通过二极管中的雪崩过程进一步放大。总增益约为106，这意味着一个光子就能在探测器的输出端产生一个可探测的脉冲。混合探测器的传输时差（定时抖动）极低，且无后脉冲。bh HPM-100 系列混合探测器基于 Hamamatsu HPD。
SPAD – 单光子雪崩光电二极管
SPAD 是一种反向电压高于击穿电平的光电二极管。当检测到一个光子时，二极管会发生雪崩击穿，从而产生一个很好检测的输出脉冲。每次击穿后，电子 “淬火电路 “都会恢复正常工作。SPAD 的量子效率高，传输时间差小，但活性面积小。此外，它们还存在后脉冲现象。
超导单光子探测器（SSPD
超导单光子探测器（SSPD）由微小的超导材料微结构组成。建立超导时，整个结构会冷却到 3 开尔文以下。在该结构中通入小电流。当光子击中该结构时，超导会在短时间内中断，从而产生电脉冲。SSPD 的传输时差极短，量子效率高，可达到红外波长。缺点是有效面积小，需要冷却到极低的温度。
TTS – 传输时差
TTS 是探测器的内部定时抖动。对于 PMT，TTS 在亚纳秒范围内；对于 HPD 和快速 SPAD，TTS 在 10 到 20 ps 范围内；对于 SSPD，TTS 在几个 ps 范围内。在 PMT 和 HPD 中，光电阴极的电子发射会导致 TTS。传统的双碱和多碱光电阴极的发射是瞬时发生的，但半导体阴极（InGaAs、GaAs）的发射会出现随机延迟。这些阴极的光电子发射会对探测器的 TTS 产生 100 到 200 ps 的影响。
SER – 单电子响应
SER 是探测器对单个光电子发出的电脉冲形状。它与单光子的输出脉冲非常相似。SER 通常比 TTS 宽得多。正因为如此，TCSPC 的时间分辨率远远高于使用相同探测器作为模拟电光设备的技术。例如，混合探测器的 SER 约为 800 ps 宽，但 TCSPC IRF 可短至 18 ps。
QE – 检测量子效率
探测器的 QE（量子效率）是指光子导致可探测输出脉冲的概率。PMT 发出的脉冲是随机振幅的，因此有效 QE 取决于后续鉴别器的阈值。因此，有时会用 “阴极发光灵敏度 “来代替 PMT 的 QE 定义，即每瓦特入射光功率的阴极电流（毫安）。请参见 bh TCSPC 手册。
激发态寿命
激发态寿命是指激发态分子从被激发到返回基态所需的平均时间。
荧光寿命
就 S1 状态而言，荧光寿命与激发态寿命相同。
荧光衰减函数
大量光子和/或大量激发/发射周期发出的荧光信号的平均时间曲线。对于同质环境中的同质分子组合，荧光衰减函数为单指数函数。荧光寿命是从激发脉冲到衰减函数 1/e 点的时间。
多指数衰变
实际上，荧光衰减函数很少是单指数的。分子环境的不均匀性，荧光分子（荧光团）与蛋白质、酶和脂质结合的不均匀性，荧光团本身构象的不均匀性，或者仅仅是不同荧光分子的存在，都会导致单指数衰减的偏差。多指数衰变由具有不同寿命和振幅的多个衰变成分来描述。多指数衰变曲线的组成包含了荧光团所属系统的分子信息。解析多指数衰变函数是将 TCSPC 和 TCSPC FLIM 用作分子成像技术的关键。