利用 FLIM 进行分子成像

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目录：

分子环境参数测量

大多数荧光团的荧光寿命或多或少取决于分子环境。因此，FLIM可用于测量局部环境参数，如 pH 值、氧浓度、生理上重要的离子浓度、与 RNA、DNA、蛋白质或脂质的结合、局部粘度和局部折射率。与基于强度的方法相比，荧光寿命检测法的优势在于检测结果与传感器的浓度、样品中可能存在的吸收、激光强度、聚焦、检测器增益和其他仪器效应脱钩。下面介绍几个例子。

pH 值成像

用 BCECF 染色的皮肤组织的寿命图像。寿命是 pH 值的指标。右图：低 pH 值区域（上图）和高 pH 值区域（下图）的荧光衰减曲线

使用对 pH 值敏感的荧光探针对样品进行染色，可以通过FLIM实现显微 pH 值成像。这些探针通常有质子化和去质子化两种形式。这两种形式之间的平衡取决于当地环境的 pH 值。如果两种形式的荧光寿命不同，那么平均寿命就是 pH 值的直接指标。对 pH 值敏感的染料的典型代表是 2′,7′-双（2-羧乙基）-5-（和-6）-羧基荧光素（BCECF）。下图是皮肤组织 pH 值成像的一个示例。左图为单次指数寿命图像，右图为图像不同区域的衰减曲线。

钙成像

Ca2+离子参与大量细胞功能，如细胞内运输、膜电位、肌肉收缩、基因表达和细胞分化。Ca2+传感器的荧光寿命与 Ca2+有关，其机理是荧光团具有与 Ca 结合和与 Ca 未结合两种形式，这两种形式的荧光量子效率不同，因此荧光寿命也不同。结合型的荧光寿命高于未结合型。因此，净荧光寿命取决于Ca2+浓度。传统的Ca2+染料，如钙绿（Calcium Green）和俄勒冈绿巴普塔（Oregon Green Bapta），会显示较大的寿命变化，非常适合用于基于寿命的Ca2+测量。示例如下图所示

细胞中的Ca2+浓度可在极短的时间内发生变化。活神经元对刺激的Ca2+反应在几毫秒内发生。尽管如此，仍可通过特殊的 TCSPC FLIM 技术（如 FLITS 和 Temporal Mosaic FLIM）来测量这种效应。下图就是一个例子。

培养神经元中的 Ca2+ 瞬态。俄勒冈绿色 Bapta，通过时间镶嵌 FLIM 记录的数据，每个镶嵌元素 38 毫秒。

氯化物成像

氯化物浓度对神经元系统的功能非常重要。MQAE（一种奎宁衍生物）被用作荧光探针。MQAE 会被 Cl- 熄灭，浓度可通过 Stern-Volmer 关系从寿命变化中计算出来。下图显示了用 MQAE 染色的小鼠脊髓神经节。寿命短表示 Cl-浓度高，反之亦然。

用 MQAE 染色的小鼠脊髓节。寿命短表示 Cl- 浓度高。

分子成像中的局部粘度

局部粘度对细胞内生化反应的速率有很大影响。亚细胞水平的粘度变化已被证明与多种细胞功能不良有关。血液病、糖尿病、老年痴呆症、肝功能异常和癌症都与粘度变化有关。分子尺度上的粘度可以通过 “分子转子 “来确定。这些荧光团或多或少有两个刚性部分，通过单键连接。这两个部分可以相互旋转。旋转是一种额外的弛豫途径，与辐射弛豫相竞争。因此，内旋转能力会缩短荧光寿命。当旋转受到分子环境高粘度的阻碍时，这种弛豫途径的效率就会降低，荧光寿命就会延长。下图是利用基于 Bodipy 的传感器测量粘度的示例。

使用基于 Bodipy 的粘度传感器测量粘度。寿命长意味着粘度高，反之亦然。

分子成像中的蛋白质相互作用

蛋白质相互作用是通过供体分子和受体分子之间的 Foerster-Resonance 能量转移（FRET）来研究的。供体分子与一种蛋白质相连，受体分子与另一种蛋白质相连。如果蛋白质相连（相互作用），能量就会从供体转移到受体。这会导致供体的荧光寿命缩短。与静态成像相比，FLIM 的 FRET 实验更加定量，因为 FLIM 与浓度无关。此外，FLIM 不仅能提供传统的 FRET 效率，还能提供相互作用蛋白质的比例以及单独相互作用供体的 FRET 效率。这种 FRET 效率所产生的 FRET 距离不会被相互作用蛋白质的不同部分所抵消。请参阅通过佛斯特共振能量转移（FRET）进行的蛋白质相互作用实验。

文献：

W.Becker,The bh TCSPC Handbook

W.Becker (ed.),Advanced Time-Correlated Single-Photon Counting Applications(《高级时间相关单光子计数应用》)

References

FLIM 分子成像相关参考文献精选

更多参考文献请参见 W. Becker, The bh TCSPC Handbook, 9ed.(2021).

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Products

用于尼康 A1 / C1 / C2 的 FLIM 系统

用于尼康 A1+ 的 FLIM 系统

用于奥林巴斯 FV1000 的 FLIM 系统

用于 Leica SP2 / SP5 / SP8 的 FLIM 系统

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